[massagewarsaw]

Wszyscy zapewne słyszeli o prozdrowotnym działaniu wysiłku fizycznego na organizm. Regularne ćwiczenia, zarówno aerobowe, jak i oporowe wprawiają nas w dobry nastrój, rzeźbią sylwetkę, a zarazem zmniejszają ryzyko wystąpienia lub nasilenia wielu chorób układu oddechowego, układu krążenia (nadciśnienie tętnicze czy przewlekła obturacyjna choroba płuc) oraz m.in. cukrzycy typu 2, dyslipidemii, osteoporozy, a także - ze względu na wydzielanie endorfin, zwanych hormonami szczęścia - mogą wspomagać leczenie depresji.

Jak to w przyrodzie bywa - aby równowaga została zachowana – istnieje także grono osób, którzy lekceważą ten wspaniały, darmowy „lek”. Warto poznać zatem mechanizm molekularny oraz zmiany adaptacyjne zachodzące w organizmie w odpowiedzi na aktywność fizyczną, udowadniając przy tym sens powyższej tezy. Weźmy zatem temat pod „lupę biotechnologa”.

Głównym mechanizmem odpowiedzialnym za adaptację organizmu do wysiłku są zmiany epigenetyczne zachodzące w DNA. Epigenetyka dotyczy zmian fenotypowych związanych z ekspresją genów występującą bez zmian w sekwencji kodu genetycznego. Za zmiany adaptacyjne do wysiłku fizycznego odpowiedzialne są trzy główne mechanizmy epigenetyczne polegające na:

- metylacji reszt cytozyny w DNA - standardowo w miejscu 5’ cytozyny następuje kowalencyjne przyłączenie grupy metylowej z S-adenozylo-L-metioniny (SAM) katalizowanej przez enzym DNA cytozyno-5-metylotransferazy (DNMT) 1, 3A oraz 3B [1,2,5],

- modyfikacji chemicznych specyficznych miejsc ogonów histonów - białek stabilizujących strukturę DNA tworząc: nukleosom – oktamer złożony z histonów (H2A, H2B, H3, H4) i owiniętych wokół niego 146 par zasad oraz łącznik pomiędzy fragmentami DNA – histon H1, który odpowiada za stabilizację pomiędzy nukleosomami i kwasem nukleinowym. Przyłączenie (np. acetylacja, metylacja, fosforylacja) lub odłączenie (np. deacetylacja, demetylacja, defosforylacja) różnych grup chemicznych powoduje zmianę dostępności kodu genetycznego dla enzymów mając wpływ na zmianę ekspresji genów [1,4,5],

- regulacji transkrypcji przez mikroRNA (miRNA) - polega na przyłączeniu krótkich fragmentów niekodującego RNA (zawierających 21-26 nukleotydów) do specyficznej cząsteczki matrycowego RNA (mRNA) na końcu 3’-UTR lub 5’-UTR powodując utworzenie kompleksu degradującego – RNA-induced silencing complex (RISC) - oznaczoną w ten sposób cząsteczkę mRNA. miRNA może również tworzyć kompleksy powodujące zwiększenie ekspresji genów [1,3,5].

Zmiany zachodzące w mięśniach

Trening fizyczny wywołuje szereg zmian na poziomie metabolizmu komórek, tak aby mogły onesprostać zwiększonemu zapotrzebowaniu na energię. Zaobserwowano, że sesja ćwiczeń fizycznych powoduje wzrost fosforylacji kinazy zależnej od wapnia i kalmoduliny typu 2 (CaMKII), acetylacji histonów H3 (H3ac) genów dla miogennego czynnika wzmacniającego 2 (MEF2) oraz transportera glukozy 4 (Glut4).

Wykazano także wzrost mRNA kodujących białko MEF2 oraz Glut4. Prawdopodobnie obserwowane zmiany są skutkiem indukowanej wysiłkiem aktywacji CaMKII, która oddziałując na MEF2 powoduje wzrost ekspresji genu Glut4. Podobne wyniki uzyskano także, w reakcji na traktowanie komórek mięśniowych C2C12 kofeiną [6]. Epigenetyczna modyfikacja ekspresji genów dla komórek mięśniowych może przebiegać poprzez zmianę rekrutacji jednostek ruchowych, ponieważ aktywność neuronalna moduluje MEF2, histonową deacetylazę (HDAC) oraz modyfikacje histonów. Potencjalnym mechanizmem może być także zmiana stężenia jonów Ca2+ wewnątrz komórki podczas ćwiczeń fizycznych, która jak wykazano powoduje zmiany epigenetyczne i transkrypcyjne w komórkach mięśniowych C2C12 traktowanych kofeiną [1,5,6].

Jak wykazały badania średniej i wysokiej intensywności ćwiczenia aerobowe powodują remodelowanie chromatyny i działanie enzymów odpowiedzialnych za acetylację - histonowej deacetylazy (HDAC) oraz histonowej acetylotransferazy (HAT). Sprawdzając zmiany stężenia enzymów bezpośrednio po 60 minutach wysiłku aerobowego, a także 3 godzinach po wysiłku oporowym wykazano odpowiednio: wzrost eksportu jądrowego HDAC powodując spadek hamowania acetylacji i dzięki temu wzrost acetylazy H3K36ac, natomiast po pewnym czasie obserwowano wzrost HDAC związanej z ubikwityną pozwalając na stwierdzenie wzrostu degradacji proteasomalnej. Na dodatek stwierdzono także wzrost AMPK, CaMKII – kinaz zdolnych do aktywacji eksportu HDAC. Wykazane zmiany sugerują, iż eksport jądrowy HDAC i wzrost acetylacji histonów przyczyniają się do regeneracji komórek mięśniowych po wysiłku poprzez wydłużenie transkrypcji [8].

Równie ciekawą obserwacją jest związek pomiędzy treningiem a spadkiem metylacji genów kodujących receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów-γ koaktywator 1-α (PGC-1α), receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów-δ (PPARD), mitochondrialny czynnik transkrypcyjny-α (TFAM) oraz kinazę dehydrogenazy pirogronianowej 4 (PDK4). Opisano również związek pomiędzy intensywnością treningu a spadkiem metylacji miejsc DNA [1,5].

Regularne ćwiczenia fizyczne wywołują istotne zmiany w mitochondrialnym szlaku biogenezy, w których biorą udział PGC-1α, jądrowy czynnik oddechowy 1 (NRF1) oraz TFAM. PGC-1α jest jednym z ważniejszych czynników regulujących adaptację do wysiłku fizycznego, mitochondrialną biogenezę, a także angiogenezę. W odpowiedzi na ćwiczenia wzrasta poziom m. in. kinaz AMPK, CaMK, p38 MAPK oraz NAD-zależnej deacetylazy sirtuin-1 (Sirt-1), aktywując następnie PGC-1α.

Istotny jest również fakt, że promotor genu dla PGC-1α zawiera miejsce wiązania dla MEF2 oraz biała wiążącego element odpowiedzi na cAMP (CREB). Natomiast PGC-1α bierze udział w aktywacji MEF2 - wynika z tego, że PGC-1α może napędzać swoją własną aktywację [12]. Z kolei białko CREB jest aktywowane przez kinazy AMPK oraz CaMKII.

Następuje translokacja do jądra aktywowanego PGC-1α, gdzie bierze udział w aktywacji: jądrowych czynników oddechowych (NRF) -1 i -2, receptora powiązanego z estrogenem (ERR) α i receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów (PPAR) α i y. Z kolei aktywowane wspomniane powyżej jądrowe czynniki transkrypcyjne zwiększają ekspresję genów szlaku fosforylacji oksydacyjnej, a także metabolizmu tłuszczu i węglowodanów [12].

Interesujący jest także fakt, że miRNA bierze udział w tej regulacji – miR-33 zmniejsza ekspresję AMPK prowadząc do wzrostu β-oksydacji oraz wzrost oporności na insulinę.[13].

Podobnie jak opisuje się dobroczynny wpływ wysiłku fizycznego na zdrowie, tak zaobserwowano, iż zaledwie 9 dni odpoczynku od aktywności fizycznej powoduje wzrost oporności na insulinę, a także wzrost metylacji DNA promotora dla PGC-1α. Co ciekawe odbyta następnie sesja ćwiczeń fizycznych nie jest wstanie całkowicie odwrócić negatywnych zmian epigenetycznych zachodzących w organizmie. Powyższe badania podkreślają jak ważną w naszym życiu rolę odgrywa aktywność fizyczna [5].

Jak opisano w badaniach już pojedyncza sesja ćwiczeń zwiększa działanie cyklu kwasów trikarboksylowych, wraz ze wzrostem półproduktów cyklu takich jak: cytrynian, izocytrynian, bursztynian, fumaran powodując wzrost możliwości wykorzystania tlenu.

Czynnik indukowany hipoksją 1 (HIF-1) także bierze swój udział w adaptacji do wzmożonego wysiłku fizycznego. HIF-1 w normalnych warunkach jest w sposób ciągły poddawany ubikwitynacji i degradacji poprzez hydroksylację dwóch reszt proliny przez hydroksylazę prolilową (PHD). Enzym ten wymaga do swojego działania także tlenu, jonów Fe2+ oraz 2-oksoglutaranu (2-OG). Jak można zauważyć w warunkach niedotlenienia degradacja HIF-1 jest zablokowana i wspólnie z PGC-1α bierze udział w regulacji wewnątrzkomórkowej dostępności tlenu oraz pobudzeniu angiogenezy mięśniowej. Ponadto odnotowano, że wzrost stężenia bursztynianu działa hamująco na 2-OG oraz Fe(II)-zależną dioksygenazę wywołując m.in. stabilizację czynnika HIF-1 [5].

Interesującym odkryciem opisywanym w badaniach jest obserwacja, że β-hydroksymaślan może wpływać na epigenetyczną modyfikację ekspresji genów. Wspomniany β-hydroksymaślan jest metabolitem wytwarzanym z acetooctanu podczas reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę β-hydroksymaślanową podczas przewlekłych, intensywnych ćwiczeń fizycznych trwających kilka dni. Zaobserwowano, że jest zdolny do inhibicji HDAC1, HDAC3 oraz HDAC4 zależnie od dawki w komórkach nerki, a także H3K9ac i H3K14ac u myszy na czczo oraz na diecie ubogokalorycznej. Zatem można wysunąć wniosek, że β-hydroksymaślan jest zdolny do zmian epigenetycznych chromatyny poprzez hamowanie I i II HDAC [1].

Istnieje różnica pomiędzy profilem metylacji DNA u osób bez obciążeń oraz z wywiadem rodzinnym w kierunku cukrzycy typu 2. Zarówno jednorazowe ćwiczenia, jak i przewlekły trening tlenowy prowadzą do zmian epigenetycznych związanych z metylacją DNA w mięśniach szkieletowych.

W adaptacji do wysiłku fizycznego biorą także udział cząsteczki miRNA. Jak wykazały badania, po wysiłku o charakterze aerobowym u osób nietrenujących regularnie następuje wzrost miR-1, -133a, -133-b i miR-181a, spada natomiast miR-9, -23a, -23b oraz -31[5,9]. Po 10 dniowym treningu utrzymuje się podwyższone stężenie miR-1, równocześnie utrzymuje się spadek miR-31.

W testach wykazano także związek miR-31 ze spadkiem ekspresji mRNA dla HDAC oraz NRF1 – białek związanych z regulacją transkrypcji. Zaobserwowano ponadto związek małych niekodujących RNA z regulacją metylacji miejsc CpG (dinukleotyd cytydyna-fosforan-guanozyna)[5,9].

Ogromny wpływ na hipertrofie mięśni szkieletowych mają - jak wykazały badania - mechanizmy regulacji ekspresji genów związane z miRNA. W badaniach uwidoczniono zmiany w miR-1, -26a, -29a, -133a, -378 i -451 związane z anaboliczną stymulacją mięśni. Ponadto ekspresja miRNA jest charakterystyczna dla danego typu komórek, co potwierdzają badania mysich mięśni. Stymulując mechanicznie mięśnie myszy uzyskano wzrost ekspresji pri-miR-1-2, 133a-2 i -206, a po tygodniu zaobserwowano również wzrost aktywności enzymów biorących udział w aktywności miRNA – Drosha i exportin-5. W wyniku badań nastąpił 45% wzrost mokrej masy mięśnia podeszwowego u myszy co potwierdza udział mechanizmu związanego z miRNA w rozwoju mięśni szkieletowych [5].

Dynamika zmian miRNA różni się także w zależności od wieku – jak wynika z badań u osób starszych zaobserwowano 100-150% wzrost ekspresji pri-miR-1-1, -1-2, 133a-1 oraz 133a-2 w porównaniu z osobami młodymi. Ciekawe są obserwacje zmian miR-1 – mięśniowo specyficznego miRNA, modelatora wzrostu i regeneracji. Podczas wysiłku oporowego u osób młodych następował spadek ekspresji, natomiast u starszych nie obserwowano zmiany [10]. W innych badaniach zaobserwowano natomiast wzrost ekspresji miR-1 podczas wysiłku tlenowego [9].

W badaniach udowodniono, że istnieje wiele Polimorfizmów Pojedynczych Nukleotydów (SNPs) oraz innych biomarkerów predysponujących do uzyskiwania dobrych wyników sportowych.

Wykazano, że mniejsza metylacja DNA mioblastów u sportowców z polimorfizmem genów dla reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR) A1298C, metylotransferazy homocysteinowej (MTR) A2756G, reduktazy syntazy metioninowej (MTRR) A66G w stosunku do kontroli predysponuje do wzrostu masy i wytrzymałości mięśni [7]. Na komórkach mięśni gładkich pęcherza moczowego zaobserwowano, że systematyczne ich rozciąganie powodowało przyspieszone przejście w fazę S cyklu komórkowego powodując hipertrofię i hiperplazję mięśni dodatkowo stymulowaną hipometylacją. Ponadto hipometylacja powoduje wzrost ekspresji czynników miogenicznych Myf-5, MyoD oraz Myf-6 regulujących wzrost i różnicowanie komórek mięśniowych, prowadząc do większego przerostu mięśni w porównaniu z grupą kontrolną [7].

Uzyskaną na podstawie badań wiedzę wykorzystano do kolejnych, których celem było określenie predyspozycji genetycznej do uzyskiwania dobrych rezultatów sportowych w tlenowych lub oporowych dyscyplinach. W tym celu młodych ochotników podzielono na grupy wysoko i słabo reagujących na wysiłek oporowy ze względu na przyrost beztłuszczowej masy mięśniowej oraz przekrój poprzeczny mięśni. Wytypowano 21 cząsteczek miRNA, spośród których dla miR-378 i -29a uzyskano wartości niższe, a miR-451 wyższe u osób słabo reagujących na wysiłek [11].

W ostatnim czasie opublikowano także badania, w których porównano ekspresję miRNA po ćwiczeniach fizycznych stosując jednoczesną suplementację białka [14]. Wytypowano 5 cząsteczek miRNA, w których zaobserwowano wzrost ekspresji podczas 4 godzin odpoczynku z suplementacją białka oraz 2 cząsteczki, dla których uzyskano różną ekspresję w stosunku do placebo. Opisywano już wcześniej wpływ tych miRNA na adaptację do ćwiczeń zarówno wydolnościowych, jak i oporowych.

W szczególności poziom ekspresji miR23a/b był wyższy po wysiłku fizycznym u osób z suplementacją białka. Przy użyciu analizy bioinformatycznej wytypowano jako cel – kinazę syntazy glikogenu 3β (GSK-3β). Forma ufosforylowana GSK-3β aktywuje enzym katalizujący przemianę GDP do GTP - eIF2Bε co z kolei powoduje aktywację czynnika translacyjnego eIF2 z formy nie aktywnej eIF2-GDP do aktywnej eIF2-GTP. Z przedstawionego szlaku wynika, że prawdopodobnie miR23a/b w okresie powysiłkowym ułatwia inicjację translacji i syntezę białka miofibrylarnego.

Zaobserwowano również wzrost ekspresji miR-133B i miR-181, których przewidywanym celem jest deacetylaza Sirt-1 będąca enzymem NAD+ zależnym zaangażowanym w regulację opisywanego wyżej PPARGC1A powodując transkrypcję genów mitochondrialnych w mięśniu poprzecznie prążkowanym. Jednak bardziej prawdopodobny wydaje się mechanizm regulacji zależny od AMPK zamiast miR133b lub miR-181.

Ciekawym odkryciem jest znamienny wzrost ekspresji miR-378 u osób z suplementacją białka w stosunku do placebo – ukierunkowany na wzrost beztłuszczowej masy ciała po 12 tygodniach treningu oporowego. miR-378 oddziałuje prawdopodobnie na szlak sygnalizacji mTOR – celem działania jest inhibitor mTORC1 – DEP domena zawierająca mTOR (DEPTOR) – wpływając pozytywnie na syntezę białka miofibrylarnego. Przewidywanym celem miR-378 jest także czynnik transkrypcyjny O z rodziny forkhead typu 2 (FOXO2) - reguluje rozpad białek mięśni w udziałem ubikwityny poprzez regulację transkrypcji MURF1 i Atrogin.

W badaniach opisano negatywną regulację ekspresji mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A przez miR-494. Ponadto zaobserwowano, że po ciężkim treningu wraz ze spadkiem miR-494 wzrasta ekspresja PGC-1α. Pomimo wysokiej ekspresji miR-1 i miR-133a nie opisano zmian po wysiłkowych u osób poddanych suplementacji białka.

Postulowany w badaniach jest także związek zmian w ekspresji miRNA w rozwoju chorób związanych z zanikiem tkanki mięśniowej. Niedawno opublikowano obiecujące wyniki badań, w których zaobserwowano związek pomiędzy zmianami w ekspresji miR-181 związanymi z wiekiem, a zmniejszeniem rozmiaru mikrotubul [15]. W badaniach in vitro potwierdzono, że celem miR-181 jest gen kodujący białko Sirt-1 biorący udział w rozwoju mikrotubul związanych z wiekiem. W innych badaniach zaobserwowano zwiększony poziom miR-206 w mięśniach chorych na Stwardnienie Zanikowe Boczne (ALS) [16]. Ponadto zaobserwowano związaną z wiekiem deregulację miR-29 podczas starzenia się mięśni.

Podsumowując krótko opisane doniesienia naukowe ostatnich lat można z pełną odpowiedzialnością stwierdzić, że wysiłek fizyczny jest „głęboko zakorzeniony” w naszych genach, wpływając na szereg epigenetycznych zmian ekspresji genów, pozytywnie wpływając na nasze zdrowie. Ponadto udowodniono istnienie genów predysponujących do określonego typu treningu fizycznego, aby móc uzyskiwać jak najlepsze rezultaty. Bardzo cenne są wstępne wyniki dotyczące wpływu modyfikacji epigenetycznej na choroby dotyczące m. in. zaniku tkanki mięśniowej. Ponadto aktywność fizyczna modyfikuje nasz metabolizm ułatwiając transport glukozy do komórek mięśniowych, a także redukując insulinooporność. Mimo powyższych stwierdzeń wciąż pozostało wiele do odkrycia, więc powstanie jeszcze wiele badań zanim niektóre doniesienia zostaną potwierdzone.

W kolejnej części cyklu artykułów: „Wysiłek fizyczny a geny” zostaną opisane zmiany m.in. w układzie sercowo-naczyniowym mające ogromny wpływ na przebieg chorób związanych z tym układem.

Łukasz Głowacki